Legionellendiagnostik - Beispiel für den Einsatz einer modernen Software

Legionellendiagnostik - Beispiel für den Einsatz einer modernen Software zur automatische Koloniezählung- Notwendig bei Hochdurchsatzprozessen zur Minimierung des Auswerteaufwandes, Steigerung der Effizienz und Senkung der Kosten

Aktueller Anlass- Die Änderung der gesetzlichen Grundlage ? Trinkwasserverordnung  vom 1.November 2011 bezüglich Legionellenuntersuchungen
Am 1.11.2011 trat die Erste Verordnung zur Änderung der Trinkwasserverordnung (TrinkwV vom 3.5.2011) Kraft, die die Neuregelung in Bezug auf Legionellenuntersuchungen in Trinkwassererwärmungsanlagen enthält.
Einmal pro Jahr besteht eine Untersuchungspflicht bei Trinkwassergroßanlagen. Diese sind definiert als Speicher von mehr als 400 Litern und/oder Rohre von mehr als 3 Liter Wasser von der Abnahme des Trinkwassers bis zur der Entnahmestelle des Erwärmers. Die Untersuchungen dürfen nur von akkreditierten Laboren durchgeführt werden. Es besteht eine Anzeigepflicht von Unternehmen, die Trinkwasser in diesem Maße gewerblich abgeben, dabei sind die Untersuchungen selbständig ohne Aufforderung durchzuführen.
Risikoreich sind dabei Gebiete, die verstärkt eine Aerosolbildung von Warmwasser bewirken wie z. B. Duschen, Klimaanlagen mit Luftbefeuchter, Dentalspüleinrichtungen, Boiler und Whirlpools.

Erreger
Legionellen sind in Süßwasser oder Biofilmen lebende humanpathogene gramnegative, nicht Sporen bildende Stäbchen-Bakterien, die durch eine oder mehrere Geißeln (Flagellum) sehr beweglich sind. Es gibt mittlerweile 51 klassifizierte Spezies der Gattung.
Die bekannteste und häufigste den Menschen betreffende Erkrankung (ca. 70-90%) ist die Legionellose (Legionärskrankheit), hervorgerufen durch Legionella pneumophila. Man unterscheidet  dabei 14 Serogruppen, wobei die Gruppen 1,4 und 6 für ca. 90% aller Legionellen-Pneumonien verantwortlich sind. In vivo vermehren sich Legionellen in mononuklearen Zellen ( Makrophagen des Mund-Rachen-Raumes).

Woher kommt der Name Legionellen?
Erstmalig wurden die später als Legionellen bezeichneten Bakterien 1976 bei einem Treffen von amerikanischen Veteranen in einem Hotel in Philadelphia gefunden (daher der Name ?Legionärskrankheit?).  Diese Epidemie forderte bei 180 nachweislich Infizierten (von 4400 Teilnehmern) 29 Todesopfer. Dabei gestaltete sich die Erregersuche äußerst schwierig, erst 1977 gelang der Nachweis vom verursachenden Bakterium, isoliert aus dem Lungengewebe eines verstorbenen Veteranen.

Vorkommen
Weltweit hauptsächlich im Süßwasser verbreitet (mittlerweile auch schon im Meereswasser nachgewiesen) bei einem Temperatur-Optimum von 25-50°C. Dort sind sie in einer geringen Konzentration im Oberflächen- und Grundwasser vorhanden und stellen normalerweise keine Gefahr für den Menschen dar. Ab einer Temperatur von 60°C sterben die Legionellen ab. Intrazelluläre Vermehrung ist in Einzellern möglich.
Gefährliche Reservoirs bilden Warmwasserleitungen und ?tanks, Klimaanlagen und Armaturen. Überall dort, wo es zu einer Vernebelung von Warmwasser bei ungenügendem Durchfluss, schlechter Wartung, nur gelegentlicher Nutzung kommt, kann die sprunghafte Vermehrung der Legionellen zu Pneumonien besonders bei immungeschwächten Menschen mit Vorerkrankungen führen. Der kontagiöse Nebel, dessen Einatmen die Krankheit verursacht, besteht meistens aus einem aerosolhaltiges Luft-Wasser-Gemisch mit einem Tropfendurchmesser von ca.2-5 μm. Das Trinken von legionellenhaltigem Wasser stellt keine Gesundheitsgefährdung dar, allerdings kann die Aspiration von legionellenverseuchten Wasser auch zur Erkrankung führen. Eine Mensch-zu-Mensch-Übertragung gilt nach heutigem Erkenntnisstand als ausgeschlossen.

Nachweis
Erreger lassen sich beim Menschen aus Sputum, Bronchial-Lavage (Spülung der Bronchien mit steriler Kochsalzlösung) und Urin nachweisen. Nach §6 und §7 des Infektionsschutzgesetzes besteht bei Laboren Meldepflicht nach Erregernachweis, niedergelassene Ärzte haben eine  Meldepflicht bei mindestens zwei im wahrscheinlichem Zusammenhang stehenden Erkrankungsfällen.
Es gibt derzeit dafür 4 Nachweismethoden
1.    kulturelle Anzucht mit Differenzierung
2.    AG-Nachweis mittels ELISA im Urin
o    ELISA:nur Antigene der Serogruppe 1 (positives Ergebnis beweist Infektion)
o    24 Stunden nach Infektion seropositiv,
o    persistiert meist mehrere Wochen, selten Monate)
3.    PCR-Direktnachweis (gute Sensitivität und Spezifität)
4.    IFT-Direktnachweis (Immunfluoreszenztest) aus Sputum und Trachealsekret aber geringe Sensitivität (etwa 40-70%)

Symptome
Symptome dieser Krankheit können Schüttelfrost sowie Fieber sein, das in Schüben auf 39ºC bis 40°C ansteigen kann. Weitere mögliche Symptome sind Erbrechen und Gliederschmerzen; auch Lungenentzündungen und Nierenversagen können im Extremfall Folgen einer Infizierung über Legionellen sein. Auch eine allgemeine Übelkeit kann auf eine Infektion mit Legionellen zurückgeführt werden.
Das Pontiac-Fieber (respiratorischer Infekt) ist die milder verlaufende Variante einer Legionelleninfektion und tritt ohne Lungenentzündung auf. Die Inkubationszeit (die Zeit von dem Beginn der Infektion bis Ausbruch der Krankheit) dauert meist zwei bis zehn Tage.

Epidemiologie
Im Vergleich zur ubiquitären Verbreitung und der Anzahl exponierter Menschen ist die Anzahl an Erkrankungen relativ gering.
Vermutlich sind 3-7% aller ambulant erworbenen Pneumonien auf Legionellen zurückzuführen. In Deutschland geht man von geschätzten 15000-30.000 Fällen pro Jahr aus. Nicht alle durch Legionellen verursachte Erkrankungen werden als solche erkannt. Die Letalität (Sterbefälle bezogen auf Erkrankung) beträgt ca. 15 %, abhängig von der gesundheitlichen Konstellation des Erkrankten. Bei immundefizienten Patienten kann sie bis zu 80% betragen.
Als besonders gefährdet gilt folgender Personenkreis:
o    Ältere Menschen (Durchschnittsalter der Erkrankten: 57)
o    Männer
o    Raucher
o    Chronisch Kranke
o    Extremsportler

Konsequenzen der Neuregelung der Trinkwasserverordnung
Man geht davon aus, dass in Deutschland ca. 2 Millionen Mehrfamilienhäuser von der jährlichen  Untersuchungspflicht auf Legionellen betroffen sind. Nur akkreditierte bzw. von den Gesundheitsämtern gelistete Labore dürfen von den Hauseigentümern mit der Testung beauftragt werden. Diese Tests müssen schnell, sicher und kostengünstig sein.

Status quo
Die Prüfung auf Legionellen erfolgt durch die Anzucht von Kolonien auf speziellen Nährböden. Nach der Probenentnahme und ?behandlung (Pufferlösung, Fungizide, Antibiotika zur Wachstumshemmung der Begleitflora) wird die zu untersuchende Lösung auf eine agarhaltiges Medium einer Petrischale aufgebracht und ca. eine Woche in einem Brutschrank bei konstanter Temperatur von 36°C gehalten.
In vielen mikrobiologischen Laboren gehört das anschließende manuelle Auszählen von Kolonien immer noch zur alltäglichen Routine. Dabei kommen nach wie vor Handzähler mit Knopfdruck oder manuelle Koloniezählvorrichtungen mit Lupe und Beleuchtung zum Einsatz. Beispiele hierfür sind der Nachweis von pathogenen Erregern in der Medizin, Keimzahlbestimmung in Lebensmitteln (Gesamtkeimzahlbestimmung, Bestimmung von  Escherichia coli, Stapholococcus aureus, Enterobacteriaceae, Hefen und Schimmelpilze) oder im Wasser (Coliforme, Legionellen).
Der Grenzwert im Trinkwasser beträgt 100 KBE, Kolonien bildende Einheiten/ 100ml (auch CFU, Colony Forming Units). Bei bis zu 1.000 KBE sollten im Laufe eines Jahres Sanierungsmaßnahmen eingeleitet werden, bei einem Wert bis zu 10.000 KBE geht man von einer extrem hohen Belastung aus, bei der aber eine kurzfristige Sanierungsmaßnahme sinnvoll ist. Über 10.000 KBE/100ml gelten als äußerst gefährlich, wobei  unmittelbar Sofortmaßnahmen einzuleiten sind und oft die Anlage geschlossen oder in ihrer Nutzung stark  eingeschränkt wird.
Mikrobiologische Labore mit Hochdurchsätzen nutzen meist schon automatisierte Systeme, um die Aufarbeitung der Mengen an Petrischalten zu bewältigen.

Softwaregesteuerte Automation
Dabei ist eine genaue Bildauswertesoftware der wichtigste Teil eines automatischen Kolonie-Zählsystems, welches die Bilder erkennt und auswertet. In Bruchteilen von Sekunden muss dabei entschieden werden, ob der aufgezeichnete Punkt eine verwertbare Kolonie ist. Weitere Schwierigkeiten können auch sein:
o    Überlagerungen von Bakterienkolonien
o    Unklare, unregelmäßige Konturen von Kolonien
o    Farbunterschiede
o    Fehlerfreie Auswertungen von bis zu mehreren hundert Platten/Stunde (Hochdurchsätze)
o    Unterschiedliche Herstellungsarten der Platten (gegossen, bestrichen, spiralförmige Auftragung)  
o    Unterschiedliche Hintergründe

LabImage CC
Diese Probleme löst die seit drei Jahren am Markt befindliche Auswertungs- und Visualisierungssoftware LabImage CC (Colony Counting). In Kürze erscheint dazu die neue Version, die besonders gut für Hochdurchsatzsysteme, generell aber für auch für ?Stand-alone-Reader? geeignet ist. Bis zu 200 und mehr  Petrischalen (Maße 60/120) lassen sich in einer Stunde exakt auswerten.
LabImage CC basiert auf der leistungsstarken Plattform LabImage von Kapelan Bio-Imaging.
Ein Kennzeichen dieser Software ist die bedienerfreundliche, workflowgestützte Führung des Users durch die Auswertung.
LabImage CC zeichnet sich durch folgende Merkmale aus:
o    Automatische und sekundenschnelle Ermittlung von Kolonien
o    Optimierung der Auswertung durch flexibel einstellbare Parameter und Extraktionskanäle
o    Vielfarbendetektion
o    Individuelle Ein- und Ausblendungen von Markierungen
o    Hinzufügen, Löschen und Skalieren von Kolonien möglich
o    Automatisches Erkennen und Trennen von verbundenen Kolonien
o    Optional manuelles Trennen
o    Automatisches Update  der Datentabelle nach Trennvorgang
o    Verschieden geformte ROIs (regions of interests) möglich
o    Bis zu 3 unterschiedlich geformte ROIs gleichzeitig in einem Bild
o    Polygonale ROI erleichtert Festlegen unregelmäßiger Bereiche
o    Optimierung des Messresultates mit Hilfe der Hintergrunddefinition
o    Generieren von Makros für Einzelbilder und Bildstapel
o    Anbindung an LIMS (Labor-Informations- und Managementsystem)
o    Export der Messdaten in andere Formate

Fazit
Durch die Neuregelung der Trinkwasserverordnung und der damit verbundenen Zunahme an Routine-Laboruntersuchungen ist eine leistungsstarke Auswertesoftware für jedes damit beauftragte Labor unumgänglich.
Die manuelle Durchführung und Auswertung derartiger Tests im Hochdurchsatzbereich reicht nicht an die Qualität und Quantität automatisierter Prozesse heran. Durch den Einsatz von LabImage CC lassen sich Zeit und Kosten einsparen bei geringerer Fehlerquote im Vergleich zur manuellen Auswertung.

Mehr Informationen unter www.labimage.com